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概要

进行体内巨噬细胞特异性耗竭的能力仍然是在广泛的生理背景下揭示巨噬细胞功能的有效手段。与小鼠模型相比，斑马鱼具有卓越的成像能力，因为它们从单细胞阶段到整个幼虫发育过程中都具有光学透明度。这些品质对于体内细胞特异性耗竭变得很重要，因此可以通过显微镜实时跟踪和验证目标细胞的消除。有多种方法可以去除斑马鱼中的巨噬细胞，包括遗传（例如 irf8 敲除）、化学遗传（例如硝基还原酶/甲硝唑系统）和基于毒素的耗竭（例如使用氯膦酸盐脂质体）。在吞噬脂质体后使用含氯膦酸盐的脂质体诱导巨噬细胞凋亡可有效消耗巨噬细胞以及测试其吞噬能力。在这里，我们描述了通过静脉注射补充有荧光葡聚糖偶联物的氯膦酸脂质体来全身耗竭斑马鱼幼虫巨噬细胞的详细方案。与荧光葡聚糖共注射可以实时跟踪巨噬细胞耗竭，从验证成功静脉注射到巨噬细胞分子摄取及其最终死亡开始。为了验证巨噬细胞的高度耗竭，当在早期幼虫阶段进行氯膦酸盐注射时，可以通过快速中性红色活体染料染色来确定脑巨噬细胞（小胶质细胞）消除的水平。

Experimental workflow for in vivo macrophage-specific depletion by liposomal clodronate in larval zebrafish

背景

巨噬细胞是先天免疫系统的关键成分，在应对感染、无菌炎症和环境变化方面发挥着重要作用。将巨噬细胞的功能与不同生理环境中相互作用的细胞类型的复杂组合解耦的最有效方法之一是能够特异性地消除巨噬细胞并分析表型后果。小鼠的这种耗竭实验为巨噬细胞的作用提供了很多见解（Hua et al., 2018; Rosowski, 2020）。然而，我们对巨噬细胞功能的理解仍然不完整，小鼠模型中的细胞耗竭实验难以实时跟踪和验证。由于这些原因，斑马鱼幼虫的光学透明度和易于操作性通过对靶细胞和整个完整生物体进行实时成像，为体内高度可追溯和可处理的细胞消融提供了明显的优势。斑马鱼的基因和免疫系统也与人类的基因和免疫系统具有高度的正统性（Yoder et al., 2002; Santoriello et al., 2012; Howe et al., 2013）。此外，斑马鱼的适应性免疫系统直到幼年成年阶段才在功能上成熟（Lam et al., 2004），这使得斑马鱼幼虫成为研究独立于适应性免疫贡献的先天免疫系统的绝佳平台。

斑马鱼目前可用的巨噬细胞耗竭方法包括遗传和化学遗传操作，以及基于毒素的耗竭。巨噬细胞的发育需要转录因子Pu.1（基因名称为spi1b）以及另一种转录因子Irf8的早期和持续功能（Li et al., 2011; Shiau et al., 2015; Tenor et al., 2015）。通过基因敲除或吗啉诺（MO）反义低聚物敲低PU.1或irf8的破坏，为巨噬细胞耗竭提供了一种可靠的方法，而前者消融骨髓细胞，后者对巨噬细胞更具特异性，但也会导致中性粒细胞数量的增加（Shiau et al., 2015; Yang et al., 2020）。这些方法不适合时间控制（Rhodes et al., 2005; Li et al., 2011; Shiau et al., 2015; Rosowski, 2020），而氯膦酸盐介导的基于局部显微注射的巨噬细胞耗竭可以实现一定程度的空间和时间指定（Bernut et al., 2014）。

氯膦酸盐（也称为二氯亚甲基二膦酸盐）可以被细胞代谢以阻断线粒体呼吸，这是由于形成不可水解的ATP类似物，然后导致细胞死亡（细胞凋亡）（Rosowski, 2020）。一旦注射包封在脂质体中，氯膦酸盐很容易被巨噬细胞摄入和消除，因为它在细胞内积聚（van Rooijen and Hendrikx, 2010）。由于所使用的氯膦酸盐和脂质体磷脂对其他非吞噬细胞都没有毒性（van Rooijen and Hendrikx, 2010），这种方法允许特异性消耗已经存在的吞噬巨噬细胞。

作为我们方案设计的一部分，我们将荧光标记的葡聚糖与氯膦酸脂质体共同注射，以使我们能够验证精确和准确的注射，并跟踪氯膦酸对整个幼虫中巨噬细胞的影响。为此，在氯膦酸脂质体与荧光标记的葡聚糖静脉内共注射后，我们目视验证了这些物质成功注射到循环中，并监测了巨噬细胞对荧光葡聚糖的摄取及其随时间推移的最终死亡。我们设计了该方案，包括注射后48小时，以允许氯膦酸诱导巨噬细胞凋亡的作用实现，因为先前在鸡和小鼠中的工作表明氯膦酸的功效可能需要几天时间，具体取决于组织（Kameka et al., 2014; Ponzoni et al., 2018）。我们通过评估脑驻留巨噬细胞（小胶质细胞）的剩余数量，证实了氯膦酸盐介导的巨噬细胞耗竭在注射后48小时内的疗效，因为可以通过中性红色活体染料染色对活幼虫中的小胶质细胞进行快速分析。我们选择在幼虫早期阶段注射3 dpf（受精后几天），因为这是在血脑屏障成熟之前（Jeong et al., 2008; O’Brown et al., 2019），当时我们发现我们注射的物质很容易到达包括大脑在内的全身巨噬细胞。使用氯膦酸盐生效的 48 小时窗口，我们能够在大多数注射的斑马鱼幼虫中实现小胶质细胞的完全消融（Yang et al., 2020）。总体而言，我们发现以3dpf的48小时孵育时间静脉显微注射氯膦酸脂质体可有效消除巨噬细胞。

参考文献

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原始文献

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2. Yang, L., Jimenez, J. A., Earley, A. M., Hamlin, V., Kwon, V., Dixon, C. T. and Shiau, C. E. (2020). Drainage of inflammatory macromolecules from the brain to periphery targets the liver for macrophage infiltration. Elife 9: e58191.