2024年11月22日，大阪大学Masahiro Yamamoto教授团队，在国际知名期刊Science（IF=56.9）在线发表题为：Platelet factor 4–induced TH1-Treg polarization suppresses antitumor immunity的论文。研究了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和血小板因子4（PF4）在肿瘤微环境（TME）中的作用，以及它们对T辅助1（TH1）极化的调节性T细胞（TH1-Treg细胞）和抗肿瘤免疫的影响。肿瘤微环境（TME）中存在多种免疫抑制细胞，其中调节性T细胞（Treg细胞）是一类重要的免疫细胞，在维持免疫稳态和抑制自身免疫中发挥关键作用。然而，在TME中，Treg细胞会向TH1-Treg细胞极化，这种极化状态会抑制抗肿瘤免疫。研究发现，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）会分泌PF4，该因子可以促进Treg细胞向TH1-Treg细胞极化。在肿瘤小鼠模型中，通过基因敲除或单克隆抗体中和PF4，可以减少TME中的TH1-Treg细胞数量，增强抗肿瘤免疫，并抑制肿瘤生长。此外，研究还发现，PF4的中和抗体可以抑制TH1-Treg细胞的极化，从而抑制肿瘤生长。
介绍：
在肿瘤块中，不仅存在肿瘤细胞，还存在各种非肿瘤细胞（如免疫细胞、成纤维细胞和血管细胞），形成所谓的肿瘤微环境 （TME）。TME 中的一些免疫细胞，如细胞毒性 CD8+ T 细胞和自然杀伤细胞，发挥抗肿瘤作用，而其他免疫细胞则表现出促肿瘤功能。调节性 T 细胞（Treg 细胞）是辅助性 CD4+ T 细胞的一个亚群，在维持健康个体的免疫稳态和抑制自身免疫方面发挥着重要作用。在 Treg 细胞中，称为辅助性 T 细胞 1 （TH1） 型 Treg （TH1-Treg 细胞）的亚群在肿瘤块内高度积累并抑制抗肿瘤免疫。靶向 TH1-Treg 细胞进行去除可能是一种很有前途的癌症免疫治疗策略，因为它被认为比去除所有 Treg 细胞更安全，后者可能导致自身免疫。然而，人们对驱动 TH1-Treg 细胞在 TME 中高度积累的分子机制知之甚少。
原理：
巨噬细胞是存在于各种组织中（包括 TME）的先天免疫细胞，它们可以分化为肿瘤相关巨噬细胞 （TAM），这是一种在促进肿瘤生长和调节免疫反应中起关键作用的特殊亚群。由于先前的研究表明，单克隆抗体 （mAb） 介导的巨噬细胞耗竭会减少 TME 中的 Treg 细胞，因此我们质疑 TAMs 是否与 TME 中 TH1-Treg 细胞的存在增加有关。为了探索这种潜在的因果关系，我们开发了一种转基因小鼠模型，其中 TAM 可以通过使用称为 VeDTR 的交叉遗传细胞靶向系统进行特异性标记和有条件地耗尽。我们假设使用这些小鼠将使我们能够分析 TAM 耗竭对 TME 中 TH1-Treg 细胞群的影响，并揭示 TAMs 和 Treg 细胞之间的细胞通讯。
结果：
与其他组织驻留巨噬细胞相比，TAM 以高水平和排他性水平表达精氨酸酶 1 （Arg1）。当我们在 VeDTR 系统中选择 Cx3cr1 和 Arg1 基因时， Arg1+巨噬细胞在荷瘤小鼠中被特异性靶向。使用这些小鼠，我们发现 Arg1+巨噬细胞构成了 TAM 的主要子集，并且在其他器官中未检测到。在耗尽Arg1+TAM后，我们观察到 TME 中肿瘤生长和 TH1-Treg 细胞比率降低。然后，我们检查了Arg1+TAM是否诱导 Treg 细胞极化为 TH1-Treg 细胞。与 Arg1+TAM共培养诱导 TH1-Treg 细胞极化，即使没有直接的物理相互作用。当我们使用单细胞和批量 RNA 测序分析源自诱导 TH1-Treg 细胞极化的Arg1+TAM的体液因子时，我们确定了一种称为血小板因子 4 （PF4） 的趋化因子作为 TH1-Treg 细胞极化的诱导剂，以 CXCR3 依赖性方式。在 Arg1+TAMs 中特异性检测到巨噬细胞中 PF4 的高表达，但在其他组织巨噬细胞中未检测到。此外，我们发现高浓度的乳酸（通常与“Warburg 效应”有关）可能有助于在巨噬细胞中诱导 PF4。常规和巨噬细胞特异性 PF4 缺陷小鼠在 TME 中均表现出肿瘤生长和 TH1-Treg 细胞比率降低。最后，当我们在荷瘤小鼠中使用新生成的 mAb 对 PF4 [抗 PF4 mAb （#6-1-5）] 测试 PF4 中和作用时，TME 中的肿瘤生长和 TH1-Treg 细胞比率均降低，导致抗肿瘤免疫力增强。
结论：
作者发现 Arg1+TAM分泌的 PF4 是 TME 中 TH1-Treg 细胞积累的关键决定因素，它抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤生长。此外，PF4 中和抑制 TH1-Treg 细胞极化并抑制肿瘤生长。鉴于癌症基因组图谱的数据表明，PF4+TAM 数量的增加与人类预后较差相关，PF4 代表了癌症免疫治疗的潜在新靶点。
为探究TAMs在TME中TH1-Treg细胞高比例存在中的作用，作者开发了一种基因系统。已知TAMs表达精氨酸酶I（Arg1），其在肿瘤中高度且特异性表达。作者通过使用VeDTR小鼠系统并选择Cx3cr1和Arg1基因，能够特异性靶向并清除Arg1+ TAMs。在荷瘤的Cx3cr1-Cre/Arg1-Flp/VeDTR（LF）小鼠中，YFP仅在肿瘤浸润的CD11b+ Ly6G–细胞中检测到，且DTR在TAMs中强烈表达。注射DT后，YFP+ CD11b+细胞被耗竭，肿瘤生长显著受抑，证明了TAM耗竭系统的有效性。
作者发现，Arg1+ TAMs的耗竭对TME中TH1-Treg细胞的状态有显著影响。流式细胞术和质谱流式细胞术分析显示，MC38和B16F10肿瘤中Foxp3+ T-bet+ CD4+ T细胞（TH1-Treg细胞）的比例显著降低。此外，T-bet+ LAG-3– CD8+ T细胞的比例增加，而其他细胞群的比例相对不变，表明Arg1+ TAM耗竭导致免疫抑制性的TH1-Treg细胞减少，免疫刺激性的CD11b+细胞和T-bet+ LAG-3– CD8+ T细胞增加，从而增强了抗肿瘤免疫。
机制上，TAMs分泌PF4，使Treg细胞极化为TH1-Treg细胞。作者对肿瘤中Arg1+ TAMs和Treg细胞的定位进行检测，发现它们距离很近，可能存在相互作用。共培养实验表明，Arg1+ TAMs可使非TH1-Treg细胞极化为TH1-Treg细胞。通过RNA测序分析，作者确定PF4为候选因子。重组PF4蛋白以CXCR3依赖的方式诱导TH1-Treg细胞极化。PF4还增强了TH1-Treg细胞的抑制功能，并且发现其在Arg1+ TAMs中特异性高表达。此外，IFN-γ参与了Treg细胞上CXCR3的初始表达，PF4进一步增强了TH1-Treg细胞极化。TME中PF4的主要来源是Arg1+ TAMs，因为它们比产生CXCL9的cDC1s更为丰富。
作者构建了Pf4−/−小鼠，发现其Arg1+ TAMs和非巨噬细胞类型中的PF4产生被消除。与野生型小鼠相比，Pf4−/−小鼠的肿瘤生长延迟，肿瘤中TH1-Treg细胞比例显著降低，而脾脏中的比例相当。为评估巨噬细胞来源的PF4的贡献，作者构建了Cx3cr1-Cre/Pf4fl/fl小鼠。在这些小鼠中，Arg1+ TAMs中的PF4产生存在缺陷，但血小板中的PF4产生正常。肿瘤生长减少，肿瘤中TH1-Treg细胞比例降低，表明巨噬细胞来源的PF4在促进TH1-Treg细胞积累和肿瘤生长中起主要作用。
最后，生成了一种新的PF4单克隆抗体（#6-1-5），可有效中和PF4诱导的TH1-Treg细胞极化。在荷瘤小鼠中施用抗PF4 mAb（#6-1-5）可减少肿瘤生长并降低肿瘤中TH1-Treg细胞比例，而脾脏中的比例不变。这伴随着IFN-γ+/TNF-α+ CD4+ T细胞和CD8+ T细胞比例的增加，表明抗肿瘤免疫增强。抗PF4 mAb治疗不影响Treg细胞向TME的迁移，也对CD8+ T细胞无直接影响。抗肿瘤效应依赖于免疫，因为在RAG2缺陷小鼠中该效应消失。PF4中和也被证明比完全耗竭Treg细胞更安全。与抗CTLA4 mAb的比较表明，抗PF4 mAb即使对TH1-Treg细胞的适度减少也能有效增强抗肿瘤免疫。对TCGA数据的分析显示，较高的PF4表达水平与癌症患者较差的预后相关。
总之，研究确定了Arg1+ TAM分泌的PF4是TME中TH1-Treg细胞积累的关键决定因素，其抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤生长。基因敲除或抗体介导的PF4中和抑制了TH1-Treg细胞极化并减少了肿瘤生长。这些发现为TME中抗肿瘤免疫调节的分子机制提供了新见解，并提示PF4作为癌症免疫治疗的潜在靶点。未来的研究需要进一步阐明PF4的作用及其与其他因素在不同肿瘤模型和临床环境中的相互作用。
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原始文献：
Ayumi Kuratani et al. ,Platelet factor 4–induced TH1-Treg polarization suppresses antitumor immunity. Science 386,eadn8608(2024). DOI:10.1126/science.adn8608
