2024年9月13日，波士顿儿童医院/哈佛大学的Leonard I. Zon教授团队，在国际知名期刊Science（IF=56.9）在线发表题为：Transcripts of repetitive DNA elements signal to block phagocytosis of hematopoietic stem cells的论文。 作者使用斑马鱼模型和哺乳动物系统来研究HSPCs内可能阻止巨噬细胞吞噬它们的信号，揭示了调控巨噬细胞与HSPCs相互作用的一种新机制，并为如何影响HSPCs的命运提供了新的理解。

巨噬细胞（Macrophages）是我们免疫系统的一部分，它们在免疫应答、炎症反应、组织修复以及许多其他生理过程中都起着重要的作用。巨噬细胞通过吞噬细菌、死亡细胞、病毒和其他外来物质来清除它们。造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）可以分化为所有类型的血细胞，包括红血细胞、白血细胞和血小板。在某些情况下，巨噬细胞可以吞噬HSCs。例如，在骨髓移植后，巨噬细胞可能会吞噬移植的HSCs，这可能会导致移植失败。此外，一些研究也发现，在炎症或感染的环境中，巨噬细胞可能会吞噬HSCs，可能是作为一种防御机制，以防止感染扩散。

先天免疫细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞，通过区分其表面表达的分子来协调清除或吞噬垂死细胞。表面分子，如补体、调理素、暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)、钙网蛋白(Calr)和膜联蛋白I作为启动吞噬信号的信号。在特定情况下，这些表面分子在细胞表面高表达。相比之下，表面分子如β -2微球蛋白(B2m)充当“不要吃我”信号。巨噬细胞对异常HSPC有吞噬和修饰两种作用，但是机制不明。作者通过实时成像和体内细胞条形码技术证明了“吃我”和“不要吃我”信号之间的平衡分别由活性氧(ROS)和Toll样受体3 (Tlr3)激活提供。

背景介绍：

造血干细胞 （HSC） 产生所有类型的血细胞，并确保造血系统的终生维持和补充。这些成体干细胞存在于骨髓 （BM） 中的特殊微环境中，但表现出一种独特的行为，即其一小部分细胞群不断从 BM 中排出，进入血液循环——这一过程被称为“干细胞动员”。在临床上，通过暴露于粒细胞集落刺激因子 （G-CSF） 或 C-X-C 趋化因子受体 4 型 （CXCR4） 拮抗剂，通过药理学调节造血细胞因子信号传导来强制 HSC 动员，从而利用这一特性。从外周血中获取动员的造血干细胞用于随后的造血干细胞移植，例如，用于治疗癌症、自身免疫性疾病和其他疾病患者。

在胚胎发育过程中，巨噬细胞与血液干细胞相互作用，去除那些表现出高水平细胞应激的细胞。存活的造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 可以在成人中增殖并产生血细胞系。Pessoa Rodrigues 等人使用斑马鱼模型和哺乳动物系统来研究 HSPC 中可以防止巨噬细胞吞噬它们的信号。与先天免疫核酸感应相关的分子促进了 HSPCs 表面 β-2-微球蛋白的表达，从而提高了它们与巨噬细胞相互作用时的存活率。损害该途径减少了成年斑马鱼中不同干细胞克隆的数量。

造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 在一生中都会产生成熟的血细胞。在此过程中，HSPC 与骨髓生态位中存在的各种细胞（包括巨噬细胞）相互作用。这些巨噬细胞通过释放细胞因子和趋化因子并巡逻以去除应激、死亡或衰老的细胞来介导无数过程。以这种方式，巨噬细胞有助于维持组织稳态。在造血过程中，巨噬细胞确保正常造血干细胞的质量，并决定参与成体造血的造血克隆的数量。然后，它们要么完全吞噬干细胞，称为“厄运”，要么捕获干细胞细胞物质的一部分，称为“修饰”。梳理后，干细胞继续分裂，而注定失败的 HSPC 克隆被消除。

Calr的表达可由与ROS相关或不相关的过程诱导

作者发现斑马鱼HSPC的ROS水平和表面的Calr呈正相关，表明了ROS水平代表了更高的表面Calr表达。为了系统地评估HSPCs中触发表面Calr呈递的途径，作者筛选了1200个生物活性小分子，发现93种化合物在细胞中以强大的剂量依赖性反应增加表面Calr，54种与ROS增加相关(ROS依赖性)，而39种不影响ROS水平(独立于ROS)。93种Calr诱导剂中有22种以依赖于Calr3b的方式促进了巨噬细胞-HSPC相互作用。Ros依赖性和Ros非依赖性化合物都以相似的水平增加巨噬细胞-HSPC相互作用比率。这些结果表明，细胞表面Calr水平决定了巨噬细胞-HSPC相互作用。

HSPC ROS水平决定巨噬细胞吞噬或者修饰

接下来作者探讨了ROS依赖性和非依赖性化合物如何影响HSPCs与巨噬细胞的相互作用，以及这种相互作用如何决定HSPCs的命运，即被清除（dooming）或被保留（grooming）。研究发现，抗氧化治疗阻碍了暴露于ROS依赖性化合物的人类HSPCs表面热休克蛋白CALR的水平。因此，推测促进清除的化合物可能与由于线粒体功能障碍导致的更高ROS水平有关。相比之下，不依赖于ROS的化合物增加了HSPCs的增殖，这与增加的保留行为一致。这些结果暗示，HSPCs上的表面Calr呈现可以诱导巨噬细胞的交互，但该交互的结果也由HSPCs的细胞ROS水平决定。ROS依赖性化合物刺激了清除行为和HSPCs的死亡，而ROS非依赖性的化合物则刺激了保留行为和HSPCs的增殖。此外还测试了ROS非依赖化合物的体外处理的巨噬细胞的趋化性和吞噬活性。发现ROS独立的Calr诱导剂并未改变固有的巨噬细胞功能。因此，ROS独立化合物通过驱动巨噬细胞介导的HSPCs保留行为，而不是诱导巨噬细胞自身效应，来实现其效果。

Tlr3是HSPC修饰所必需的

研究人员选择了DL-PPMP作为ROS独立的CALR诱导剂来探讨ROS独立化合物如何诱导HSPCs表面CALR的表达。为了定义需要表达表面CALR的复杂网络，研究者使用了一种递送敲除文库的逆转录病毒，该文库针对18,080个基因。作者将DL-PPMP或DMSO（对照）处理的K562人类白血病细胞进行分选，以获得CALR-细胞并富集其中的单向导RNA (sgRNA)。作者发现DL-PPMP刺激细胞中富集的基因与胞质DNA/RNA感应和病毒免疫反应有关。在验证实验中，TLR3的消耗降低了K562细胞中的表面Calr，表明胞质DNA和/或RNA可能调节表面Calr的增加。

研究进一步探索了DL-PPMP触发的分子机制，并研究了Tlr3信号如何影响HSPCs的命运。作者分析了先前可获得的DL-PPMP处理过的人类癌细胞系的大量RNA测序数据。他们发现2285个上调基因与病毒免疫反应相关的途径有关，例如干扰素-a（IFN-a）的产生、抗原处理以及通过MHC I类处理内源性肽的呈现。在使用DL-PPMP处理的K562细胞中B2m（一种需要用于细胞表面的MHC-I稳定的分子）的表达水平较高。作者评估了Tlr3斑马鱼形态素消耗后中HSPCs表面的B2m水平。他们发现在斑马鱼胚胎中消耗Tlr3导致B2m+ HSPCs的数量减少。研究结果表明，由于Tlr3表达水平较低导致的B2m表达降低，使得HSPCs更加倾向于被巨噬细胞清除。

表面B2m决定Calr介导巨噬细胞-HSPC相互作用的结果

接下来作者用ROS独立的化合物处理48hpf的斑马鱼胚胎，并使用荧光激活细胞分选（FACS）评估了HSPCs上的表面B2m。他们发现ROS独立的化合物增加了B2m水平，而"eat-me"或iTlr3处理则降低了表面B2m水平。作者生成了B2m稳定敲除的斑马鱼以确认B2m在巨噬细胞介导的HSPC保留中的角色，观察到B2m消耗增加了HSPC的清除行为并减少了HSPC的保留行为，进一步支持了表面B2m作为HSPCs上的"不要吞噬我"信号的角色。接下来，他们用ROS独立的化合物DL-PPMP处理了B2m敲除的胚胎。他们观察到，DL-PPMP在WT和B2m敲除的胚胎中都刺激了相互作用。然而，B2m敲除的HSPCs被清除，而WT HSPCs则被保留。Tlr3激活级联可能促进Irf3激活，从而促进b2m的转录。

作者进一步使用IFN-stimulated gene 15 (Isg15)作为Tlr3-介导的Irf3反应的报告基因以研究HSPC种群的内在异质性。qPCR分析显示，Runx1+Isg15+细胞中的内源逆转录病毒和B2m表达均有所增加，这表明RE (repetitive elements)转录水平较高的HSPC也有更高的B2m水平。重新分析已发布的单细胞RNA-seq数据，发现富含细胞周期基因表达的细胞群的RE表达较高，这表明准备进行增殖的HSPC有更高的RE表达。通过增加整体RE的表达或过表达特定的RE（Ltr4），都能保护HSPC免受巨噬细胞的清除。这些研究结果表明，通过增加内源逆转录病毒的水平，可以提供对HSPC清除的保护。作者注意到，内源逆转录病毒（ERV）的蛋白质和遗传物质已经被证明能够调控内源性免疫反应。在病原体感染时，ERV衍生的增强子和启动子似乎会被激活，这表明内源性免疫反应和ERV之间可能存在协同激活或训练免疫反应的功能。所以进一步评估了Tlr3信号在“应急粒细胞生成”中的角色。他们发现，poly I:C刺激后，中性粒细胞的数量增加，这表明可能诱发了应急粒细胞生成。他们还发现，急性髓系白血病（AML）的恶性HSPCs以及人类AML blast中，B2M和TE的表达较高。这表明AML细胞可能会“劫持”“不要吃我”信号来避免被巨噬细胞清除。总的来说，这些数据表明，RE-Tlr3的病毒模拟信号调控HSPCs上的B2m表达，以促进巨噬细胞介导的清除行为，并保护HSPCs免受巨噬细胞的消亡，塑造了HSC的命运决定和克隆增殖。

总之，作者的研究结果支持一个模型，在该模型中，内源性 TLR3 配体导致 b2m 的表达，从而阻断巨噬细胞诱导的厄运，并通过用巨噬细胞监测干细胞质量来确定造血干细胞克隆性。Calr （“吃我”）和 B2m（“不吃我”） 的平衡控制着通过巨噬细胞介导的质量保证为成人血液系统做出贡献的长寿命 HSC 克隆的数量。这揭示了 HSPC 克隆扩增和免疫调节细胞清除之间错综复杂的相互作用。作者提出，这种保护机制也可能在成年期响应环境压力而发挥作用，例如在感染期间或克隆干细胞疾病中。通过利用巨噬细胞选择性去除突变干细胞克隆，操纵“don't eat-me”和“eat-me”信号的水平可能对免疫疗法具有重要的治疗意义。

相关研究一：巨噬细胞对造血干细胞HSC的质量控制

2022年9月22日，Science发表题为Quality assurance of hematopoietic stem cells by macrophages determines stem cell clonality研究论文，巨噬细胞是造血干细胞HSC质量的控制者。详情参考链接：巨噬细胞对造血干细胞HSC的质量控制。 在2022年9月22日发表的论文中，作者使用了我们荷兰Liposoma的巨噬细胞清除剂Clodronate Liposomes（货号CP-005-005）氯膦酸二钠脂质体巨噬细胞清除套装。在2024年8月9日的这篇研究中，作者使用了巨噬细胞示踪荧光脂质体Dil Liposomes。

相关研究二：巨噬细胞通过胞啃作用介导膜物质转移到造血干细胞HSC

原始文献：

Cecilia Pessoa Rodrigues et al.Transcripts of repetitive DNA elements signal to block phagocytosis of hematopoietic stem cells.Science385,eadn1629(2024).DOI:10.1126/science.adn1629. https://www.science.org/doi/10.1126/science.adn1629