巨噬细胞无论是在维持机体的生理稳态还是斡旋组织的病理炎性，都发挥重要的作用。此外，巨噬细胞也促进多种疾病的病理生理学，如包括癌症和各种炎症性紊乱。巨噬细胞功能的多样性也正如它起源的复杂性（当然争议性更大），形态的异质性，表型的可塑性。因此，巨噬细胞作为一种具有可塑性，多能性和异质性的细胞群体,在体内和体外不同的微环境影响下,表现出独特的表型和功能，体现的是一个在时间和空间上受一系列机体免疫学网络所调控的复杂动态连续性生物学过程。
为了更好的研究巨噬细胞功能，设计研究实验时，要在时间上（疾病的发生和发展）和空间上（病灶的原位，组织，器官）考虑到巨噬细胞的起源，更新，补充，形态，表型和功能的连续性，动态性和网络性。
Q1.为什么Clodronate Liposomes（氯膦酸二钠脂质体）是研究巨噬细胞功能的利器？
A1：巨噬细胞在免疫系统中发挥重要作用。它们主要通过可溶性分子，如细胞因子和趋化因子的介导来调节许多非吞噬细胞的功能。巨噬细胞还通过摄取和消化微生物或非自身颗粒和大分子参与身体的“稳态”。内吞物的消化是由其溶酶体酶介导的。
脂质体是人工制备的脂质囊泡，由夹带水性隔室的同心磷脂双层组成。它们可用于包封溶解在水溶液中的强亲水性分子，例如氯膦酸盐，一种为人类应用开发的无毒二膦酸盐。
注射后，氯膦酸盐脂质体起到特洛伊木马的作用。巨噬细胞摄取氯膦酸盐脂质体并消化脂质体膜。氯膦酸盐不会被消化，并会留在巨噬细胞内。更多氯膦酸盐将在巨噬细胞中积聚，因为它会摄取和消化更多的氯膦酸盐脂质体。当氯膦酸盐在细胞内聚集到一定的浓度后，氯膦酸盐会通过启动其程序性细胞死亡即细胞凋亡来清除巨噬细胞[1]。
通过选择氯膦酸盐脂质体的正确给药途径，给药时间点，给药频率和给药部位，可以清除特定器官或组织中的巨噬细胞。因此，氯膦酸盐脂质体是研究巨噬细胞功能的极好工具[2]。
Q2.Clodronate Liposomes（氯膦酸二钠脂质体）和Clodronate（氯膦酸二钠）的半衰期是多少？
A2：死亡巨噬细胞释放的氯膦酸盐的半衰期（t1 / 2）为数分钟[3]，因为游离氯膦酸盐通过肾脏系统迅速从循环中被清除。 由于难以通过细胞膜，游离氯膦酸盐分子不易进入细胞，包括脂质体磷脂双分子层。 然而，如果它们留在周围的介质中，它们可能会慢慢积聚到细胞中[4]。
氯膦酸盐脂质体的半衰期很难确定。 脂质体难以从血液中分离，并且它们在动物中的分布不均匀。 此外，氯膦酸盐脂质体的半衰期取决于巨噬细胞摄取和消化所需的时间，这由许多因素决定，例如：动物疾病模型的免疫全能性，给药途径，给药剂量。
Q3.实验清除巨噬细胞不成功，可能的原因有哪些？
A3：氯膦酸盐脂质体活性的失败可能是由于各种原因：
1）有效期已过：超过有效期后无法确保活性;
2）在极端温度下储存：氯膦酸盐脂质体应储存在4到8摄氏度之间。冷冻脂质体或温度高于30摄氏度会影响膜的稳定性并降低氯膦酸盐脂质体活性;
3）脂质体悬浮液的稀释：这会影响悬浮液中的渗透压，这可能导致脂质体膜的不稳定;
4）给药方案不合理：给药方案应仔细选择并考虑多种因素，例如：
a.打算消耗的巨噬细胞的类型（例如库普弗细胞，小胶质细胞，肺泡巨噬细胞，破骨细胞）。例如，可以通过气管内给药靶向肺泡巨噬细胞，而内皮/上皮屏障另一侧的间质巨噬细胞不会被该给药途径靶向;
b.是否打算短期或长期消耗它们;
c.动物的体重：较大的动物需要更多的氯膦酸盐脂质体才能达到清除阈值。
5）脂质体悬浮液在使用前未重新悬浮：脂质体在储存期间倾向于沉淀，确保在使用前轻轻摇动重悬，以防止仅注射不含脂质体的PBS溶液;
6）注射时出错：确保注射是否成功非常重要。例如，如果您在尾静脉注射期间看到鼓包形成，则可能是您注射到皮肤组织了，没有注射到静脉里。当腹膜内注射时，确保将脂质体悬浮液注射到腹腔内（而不是在肠内）。为了验证脂质体是否已到达您想要的位置，可以使用荧光Dil脂质体;
7）检验清除的手段是否正确：需要选择正确的标记来确定清除是否成功。此外，您需要考虑到每种给药方案和（动物）模型的巨噬细胞的消耗和再增殖动力学不同。
Q4.实验动物在注射后立即死亡，可能的原因有哪些？
A4：这很可能是由于注射了非均质的沉淀脂质体。 沉淀的脂质体可引起栓塞，从而部分或完全阻断动脉或静脉中的血流。 由于脂质体在储存期间容易沉淀，因此请确保在使用前颠倒混匀。
另一个原因可能是脂质体悬浮液的温度。 脂质体应储存在4到8摄氏度之间，但应平衡到室温后给药。
注意：如果注射需要较长，脂质体可能在注射器中沉淀，当使用相同的注射器注射多只动物时，这可能导致差异剂量。
Q5.实验动物在注射后数小时或者数天死亡，可能的原因是什么？
A5：这很可能是由注射前或注射过程中的微生物污染引起的。当注射氯膦酸盐脂质体时，巨噬细胞的清除可使动物更容易受到感染，尤其是免疫缺陷动物。
Q6.如何存储脂质体悬液？
A6：储存在4-8ºC（或39-47ºF）之间。 脂质体悬浮液不应该冷冻，也不应暴露在极端高温下。
Q7.氯膦酸二钠脂质体悬液的浓度是多少？
A7：平均而言，整个脂质体悬浮液的浓度为5mg氯膦酸盐/ mL。 氯膦酸盐以CH2Na2Cl2O6P2·5H2O的形式包封在脂质体囊泡中。
Q8.脂质体的粒径和电荷是多少？
A8：所有的脂质体（即氯膦酸盐，PBS和荧光Dil脂质体）都带有轻微带负电，因此不会聚集在一起。 悬浮液中的脂质体没有按特定的粒径截留，脂质体的大小不等（最大3微米）。 平均而言，脂质体的大小为1.7微米。
Q9.溶解脂质体的缓冲液是什么？
A9：所有的脂质体制剂（即氯膦酸盐脂质体，对照脂质体和荧光Dil脂质体）悬浮于无菌磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）：10mM Na2HPO4,10mM NaH2PO4，>140mM NaCl中。
Q10.如何检测荧光Dil脂质体？
A10：用荧光染料DiI标记的脂质体，作为对照，可用于研究脂质体是否已通过所选的给药方案达到靶向的巨噬细胞群。 荧光标记将显示脂质体在组织内的分布模式及其对巨噬细胞的摄取。 Dil标记的脂质体可以通过流式细胞术和荧光显微镜检测。 DiI分子的激发和发射分别为549和565nm。
Q11.发表研究成果时，如何引用LIPOSOMA的产品？
A11：当用LIPOSOMA的脂质体制剂用于实验并打算发表研究成果时，引用格式：“LIPOSOMA，the Netherlands（clodronateliposomes.com）”。
参考文献：
1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.
2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.
3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.
4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.
